1 引 言
基于MEMS技术的生物微反应器在细胞和组织培养中显示出越来越多的优越性，成为组织工程的研究热点。在生物微反应器中培养细胞或组织，实时获取细胞或组织的生存状态是考察其培养质量的重要依据。表征细胞和组织生存状态的参数很多，如培养液中葡萄糖浓度、pH、乳酸代谢浓度等，其中pH是其中一个重要参数，直接反应了组织或细胞的生存状态。
光纤pH传感器以其无需与待测溶液接触、成本低、易集成等优点而受到了诸多研究者的关注，其原理是根据pH变化时溶液的光学性质随之发生变化，由此衍生出吸收光度、荧光、消逝波等方法。光纤pH传感器大多通过在光纤端部或者侧壁制备pH敏感膜，这无疑增加了传感器制备的复杂性，并且难免造成培养液的污染，不符合细胞或组织培养过程无菌化的要求。
生物微反应器中细胞或组织培养液含有酚红，当pH从6.6升至8.0时，溶液颜色由黄色变为红色。本文利用这一特点，根据光度吸收原理设计了一种阵列光纤传感器。这种传感器与文献[6]的报道相似，但更具有体积小(<0.8μL)、非接触、无污染的特点，并可同时检测多个生物微反应器的pH值。
2 实验方法和设备
2.1 传感器设计
阵列光纤传感器由低成本光纤、光纤夹持器和阵列吸光池芯片纽成，如图1所示。
生物微反应器中培养液经过阵列吸光池，特定波长的光源经光纤耦合到吸光池的培养液中，发生光吸收。根据朗伯-比尔定律，培养液的吸收光强和溶液浓度成正比，由此可获得培养液的pH值。
吸收光强除与溶液浓度有关，还与吸光池透光率、吸收光程等因素有关。在3.1节中通过光学模拟获得阵列吸光池的厚度方向最优尺寸，吸光池的溶液死体积决定了传感器在培养液pH发生变化时的响应速度；在3.2节中通过流体模拟获得了吸光池的结构形式，降低了死体积。
2.2 阵列吸光池芯片的MEMS加工
阵列吸光池芯片由PDMS膜和盖玻片组成，利用MEMS工艺制备而成，加工工艺主要包括SU8模具工艺和PDMS工艺，如图2所示。
首先在清洗干净的硅片上甩SU8 2100胶(美国MicroChem生产)，厚度控制在250μm，利用掩模版光刻曝光(Karl Suss MA6，德国SUSS公司生产)，显影后(SU-8显影液，英国Shipley Europe公司生产)在硅片上制成SU8模具。然后对SU8胶模具进行表面处理，将按照一定比例混合而成的PDMS(Sylgard○R184，美国Dow Corning公司生产)液体倒入模具中，常温下凝固2～3 h，通过精密定位的方法获得厚度为450 μm的PDMS薄膜。待PDMS凝固后将其从SU8模具上剥离，在成型的PDMS做流体芯片上沟道末端位置开孔，采用RIE(反应离子刻蚀)对PDMS膜进行表面处理，然后将其与清洗干净的载坡片通过化学键直接结合在一起，构成可逆封装．组成阵列吸光池芯片。
将阵列吸光池芯片放置于精密加工的光纤夹持器中，通过螺钉将芯片紧固，在夹持器中插入光纤，使光纤端面和芯片接触，涂胶固定，即可获得光纤阵列传感器。
2.3 吸收光度检测装置
采用中心波长565 nm的LED(美国HewlettPackard公司生产)作为光度检测器的激发光源，通过直径为1.5/0.8 mm的光纤(中国台湾Riko Electronic Technology公司生产)耦合到芯片一侧．在另一侧通过相同的光纤传输至光电二极管(PXR0108，英国Afonics Fiberoptics公司生产)作为接收器，由此光信号通过自制的微弱电流放大器转换为电压信号，通过12位ADC212数据采集卡(英国Pico Tcchnology公司生产)送到PC机中进行记录。
2.4 实验过程
所有的试验均在避光暗室中操作进行。为了获得传感器的标准曲线和响应时间，细胞培养液(DMEM，含15 mg／L的酚红，美国Sigma-Aldrich公司)经浓度为5 mol／L的NaOH溶液调制，将溶液pH调为6.8～7.8，其他试剂均为分析纯，水为去离子水。
采用注射泵PHD 2000(美围Harvard Appara-tus公司)将不同pH的培养液依次注入，待信号稳定后分别记录不同浓度下的输出响应。
3 结果与讨论
3.1 光学模拟
利用Zemax软件进行光学模拟，研究吸光池厚度对光传输效率的影响。
根据加工条件，选择PDMS膜厚度0.2 mm、折射率1.45，培养液近似为水溶液、折射率1.33，盖玻片厚度0.13 mm、折射牢1.41，光纤孔径0.4、内径0.8 mm、外径1.5 mm，LED光源中心波长565 nm。
阵列吸光池的厚度变化从50 μm到2000 μm，模拟结果如同3所示。由模拟结果可知，当吸光池厚度小于300μm时，光传输效率大于90％。增加吸光池厚度呵以增加吸收光程，在理论上可提高检测灵敏度，但是光程增长将导致光纤光束发散，造成光纤传输效率下降，因此兼顾SU8工艺，选择吸光池厚度为250μm、此时光传输效率为0.92。
3.2 微流体模拟
利用CFD(computational fluid dynamics)软件进行微流体模拟，研究吸光池的结构形式对培养液死体积影响。
根据芯片的加工条件和光纤最小直径要求，吸光池的厚度为250μm、最小直径为1.5 mm。定义流速小于正常流速的20％区域为溶液死体积。
取生物微反应器工作时的最高流速(0.5 mL／h)和最低流速(0.03 mL／h)，观察这两种极限条件下的吸光池溶液死体积。本文比较了圆形和椭圆形两种吸光池形状，仿真结果如图4所示。
由模拟结果可见，椭圆形的吸光池溶液死体积明显小于圆形吸光池，因此本设计选择椭圆形吸光池。虽然缩小椭圆形吸光池的短轴距离能进一步降低溶液死体积，但考虑到光纤的外径为1.5 mm，因此本文选择长轴为2 mm、短轴为1.5 mm的椭圆形吸光池。
3.3 响应时间与检测灵敏度
图5为生物微反应器pH由7.0突变为7.4时的传感器响应输出。图5(a)为最高流速条件下的传感器响应，圆形和椭圆形的吸光池传感器响应相差不大，大约为100 s。图5(b)为最低流速条件下的传感器响应，椭圆形吸光池的响应时间约为圆形吸光池的1／2。由此可见，椭圆形吸光池可有效的降低溶液死体积，提高传感器的响应速度，适于生物微反应器的pH在线监测要求。
图6为培养液pH在6.8～7.8变化时的传感器输出曲线，传感器的线性相关系数为0.964，按照3σ计算出传感器的检测灵敏度0.83 V／pH。
和相同原理的光纤pH传感器相比，本文所研制的阵列光纤传感器灵敏度高，所需溶液体积小(<0.8μL)，特别适于生物微反应器的所需样品小、无污染等要求，并且可实现多个生物微反应器的同时监测。
4 结 论
本文采用MEMS技术研制了一种阵列光纤传感器，用于细胞或组织培养生物微反应器的pH在线监测。本传感器利用细胞培养液中含有酚红这一特点，通过优化设计吸光池的结构形式和尺寸，提高了检测灵敏度，并有效减小了吸光池的溶液死体积。实验证明，所研制的阵列光纤传感器检测灵敏度为0.83 V／pH，输出响应速度快，呵满足多个生物微反应器的pH在线监测需要。
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