现有的HBV检测，是通过检测HBV产生的5种抗原蛋白来间接检测HBV，也就是通常所说的“两对半”检测法。但有时由于使用药物得到免疫性结果，使抗原不被表达，通过检测抗原的办法来检测HBV就会产生假阴性的结果。另外，当血液中的HBV消失时，有关的抗原并不能立即消失，这样用“两对半”来检测时，又会产生假阳性的问题。为了克服上述缺陷，我们提出用DNA传感器来直接HBV的设想。据此，开发出特异性好、灵敏度高、寿命长、响应时间短、能重复使用检测HBV的DNA传感器是至关重要的。

      1　传感器的制备

      1. 1  表面处理
  
      本研究采用的石英晶体传感器，其镀金表面在使用前要经过预处理，以除去表面的有机杂质。处理方法是：取AT切石英晶体，先用超声波清洗5min，再用Piranha溶液浸泡30min，最后依次用纯净水、丙酮、无水乙醇、纯净水清洗。N2干燥后测定石英晶体的基频F0。

      1．2   DNA探针的固定

      1．2．1自组装法固定

      探针固定液是将带有已硫醇标记的DNA探针，用0.3MNaC1 pH7.9溶液溶解为10μg/mL，取0.26mL DNA探针固定液，在DNA固定容器中浸泡预处理过的石英晶体1h，然后用纯净水清洗。最后用氮气干燥系统干燥，测定所用石英晶体的频率F1，计算出固定所引起的频率改变量 F0（ F0=F1-F0）。所有制备过程均在室温下进行。

      1．2．2   生物素膜法固定
  
      其固定方法是将预处理过的石英晶体，用0.26mL 1mM3.3-二硫丙酸浸泡金表面30min，然后用纯净水清洗，N2干燥系统干燥，测定石英晶体频率F1。再用0.25mL 100mg/mL EDC和5μL 100mg/mL NHS溶液浸泡30min，浸泡后再用纯净水清洗，N2干燥系统干燥，测定石英晶体频率F2。然后依次用0.26mL0.2mg/mL抗生素浸泡90min，0.26mL 1mM2-氨基乙醇（pH=8.0）浸泡60min，0.26mL生物素标记过的DNA探针固定液浸泡60min，用纯净水清洗，N2干燥系统干燥，测定石英晶体频率F3。所有制备过程均在室温下进行。计算固定引起的石英晶体振荡频率改变量 F0（ F0=F3-F2）。

      2　传感器的应用

      2．1   样品的处理
 
      血液样品预处理：取回的血液样品先经过离心除去红细胞，离心条件为900转/min，离心5min。然后取上层血清，加入氯仿/苯酚溶液（体积比为血清/溶剂=2/1），静置3min，然后以12000转/min离心5min，除去蛋白，取上层血清作检验血清。

      2．1．2 将制备好的血清样品在水浴锅中99℃变性处理10min。

      变性完成后，立即取0.26mL样品，置于杂交容器中，恒温48.3℃，用前面方法所制备的石英晶体DNA传感器进行杂交检测。杂交时间为60min。用正常血清样品作对照实验，比较检测结果。

      3　讨论
     
      3．1．1  固定量的比较
  
      自组装方法和生物素膜法固定的DNA探针，所引起的石英晶体传感器频率改变量 F0，通过表1进行了对比。

      从表1中列举的数字来看，用生物素固定后石英晶体频率的改变量其平均值为166.6Hz；用自组装法固定石英晶体频率的改变量其平均值为135.6Hz。生物素膜法固定的量是自组装法固定量的1.2倍。

      3.1.2   稳定性比较

      稳定性是DNA传感器研制中的一个关键参数。只有石英晶体表面固定的DNA能稳定存在，后继的检测工作才能正常进行。稳定性主要是指固定的DNA在恶劣的环境中会不会脱落，例如在强酸或强碱溶液中。为了了解DNA固定的稳定性，将固定好的DNA传感器用1mM/mL HC1溶液或1mM/mLNaOH溶液浸泡4min，然后用纯净水清洗后，氮气干燥，测定浸泡后的晶体频率，计算出浸泡后引起的频率改变量，得出结果见表2、表3。

      表2　1mM/ml HCl溶液浸泡后引起频率改变量对比（Hz）

      表3   1mM/mL NaOH溶液浸泡后引起频率改变量对比（Hz）

      注：表中的频率改变量为晶体频率上升的量，负号表示下降。

      从上述两个表中可以看出，用自组装法固定的DNA传感器，在浸泡后频率趋于上升，上升量约为20Hz多。这说明经过强酸或强碱处理后，用自组装法固定在石英晶体表面的DNA发生了脱落。用生物素膜法固定的DNA，在经过上述处理后，其频率改变量很小，表明用此法固定的DNA探针稳定性比较好。

      3．2  血清样品对照检测
     
      3．2．1  取样

      样品由广州军区广州总医院检验科提供，一种是已被免疫法检测出含有高拷贝数的乙肝病毒，另一种是正常人的血液样品，同样也用免疫法检测，证明不含有乙肝病毒。

      3．2．2  检测

      根据前面所讲的样品处理方法，对样品进行处理，取出不含蛋白的血清，在99℃变性处理，使DNA双链解链成为单链，最后在48.3℃条件下，利用固定有乙肝病毒特异性DNA探针的石英晶体传感器定性杂交检测，记录杂交检测所引起的石英晶体DNA传感器频率的下降值，得结果如表4。

      从表4中可以看出，石英晶体DNA传感器可以准确检测出血清样品的乙肝病毒，其频率改变量平均为312.4Hz，变化量很明显，可以用仪器检测出来。

      表4　真实样品的检测结果   （Hz）