1 引 言
危害分析与关健控制点系统(hazard analysisand critical control point，HACCP)是当今许多国家公认的、最有效的保障食品安全的管理方法，正逐渐应用于食品行业，其中，食品卫生表面微生物检测是一项重要内容。目前，我国大多食品企业主要通过传统的平板计数法来检测物体表面菌落数，存在需要培养微生物、操作繁琐、检测周期长、检测结果明显滞后等问题，无法满足HACCP管理系统的要求。
近年来，电阻抗法、膜过滤法、电极法及ATP生物发光法等快速检测方法逐渐被开发出来，其中，ATP生物发光技术最为快速、简便，是一种有潜力应用于HACCP体系的检测方法，成为国外研究工作者的研究热点，但该方法在国内还处于起步研究阶段。国外在20世纪90年代中期就已经开发出ATP荧光仪，并已应用于食品卫生的现场检测中，但受灵敏度及检测成本等的限制，在我国尚未得到广泛推广应用。因此，有必要开发出快速、简便、成本低廉的微生物快速检测仪器，以促进HAC-CP体系和生物发光技术在我国食品卫生控制中的应用，对保障人民生活水平和健康有着重要意义。
本文基于ATP生物发光原理设计了一种新型的微生物快速检测用生物传感器，并以ATP标准品为检测对象，结合荧光分光光度计对传感器的基本特性进行了初步研究。
2 实验材料和方法
实验用ATP标准品、辅酶A和焦磷酸钾来自Sigma公司，检测试剂为自制溶液，由甲虫荧光素、虫荧光素酶及醋酸镁、乙二胺四乙酸钠、牛血清蛋白、Tris等辅助试剂组成，其中，前两者来自美国普洛麦格公司，其他试剂来自Sigma公司。以上所有试剂均为分析纯。实验用检测仪器为HitachiF4500型荧光分光光度计(日本日立公司)，检测结果以相对光强值(RLU)给出。
实验前，对一定量的ATP标准品，用25 mmol／L Tris(pH7.8)缓冲液进行溶解并稀释形成不同浓度的标准溶液，浓度为1～100 nmol／L。实验时，先将20μL ATP标准液加入到传感器的反应室内，将传感器置于荧光分光光度计的样品架上后，开始扫描检测反应室的荧光信号，此时信号为仪器自身的噪声信号。待扫描开始10 s时，通过医用注射器将80μL检测试剂加入到传感器中，此时将得到实时扫描的反应荧光信号。
3 检测原理
ATP是一种高能磷酸化合物，在生物系统中是能量交换中心，它普遍存在于一切活的微生物，如细菌、真菌和酵母菌等细胞内，为细胞内活动提供能量。在食品工业HACCP体系中，其关键控制点的表面微生物污染主要以细菌性污染为主，而各种细菌中的ATP含量大致一定(约10-18mol／个)，所以通过检测物体表面的ATP含量，可以估算出表面微生物污染情况。
ATP生物发光法检测原理为：荧光素酶在ATP、Mg2+和O2存在时，它首先与虫荧光素酰腺苷酸(由MgATP与虫荧光素复合而成)生成复合物LUC-LH2-AMP，然后该复合物释放出质子，酶变构导致虫荧光素氧化脱羧，荧光素分子中的电子由不稳定的激发态跃迁到低能级而发射出光子。当荧光素过量时，反应产生的荧光强度与ATP浓度成正比，通过检测荧光光强即可获得被测ATP的含量。
4 传感器的设计
图1为设计的光学传感系统的结构示意图。此系统主要包括4个重要组成部分，即传感器件、光探测器、电流一电压转换器和高压电源调制模块，其中，传感器件根据ATP生物发光原理设计，能将待测目标微生物通过生物化学反应转换为可被定量检测的光信号，是整个光学传感系统的核心部分。
图2给出了该传感器件结构图，它集采样部分、微生物ATP的释放及ATP检测于一体，主要由棉拭子、检测套筒、试剂蓄池及反应室组成，其中，试剂蓄池中预先储存一定量的液态微生物裂解剂，并由铝膜密封住其上下截面，铝膜在传感器使用时会在棉拭子的下移作用下被次序破开；反应室为侧壁透光性良好的检测室，通过在反应室内预先固定一定量检测试剂，该检测试剂与游离的ATP直接反应而产生荧光信号。结合相应的光信号探测器，该传感器可用来快速估测表面微生物数量，其检测流程如图3所示。
相比传统的表面微生物总数检测方法而言，该传感器沿用表面涂抹的取样方式，但由于将棉拭子、裂解溶液和检测试剂集成设计在不同部位上，在应用时无需使用其他容器和移液工具来分散样品，因此操作相对简单。此外，该传感器基于ATP生物发光原理设计，无需对微生物进行培养，检测时间大大缩短，因此在食品工业、化妆品制造业等行业及医疗卫生机构对物体表面微生物污染的快速检测与即时评估方面具有一定应用前景。
5 结果与讨论
5.1 传感器的光学响应特性
图4是传感器对标准ATP响应信号的波长扫描谱线图。由图4可见．传感器对标准ATP的响应信号在550 nm处有一窄而强的荧光发射带，该波长是反应过程中荧光素酶催化虫荧光素氧化脱羧而产生的荧光光子波长，所以选择此波长值作为传感器配套光探测器的检测波长，可以最为灵敏地探测到传感器响应的光学信号。因此，在本文的后续研究中，均选用550 nm作为荧光光度计检测传感器响应信号的波长。
5.2 传感器检测范围
传感器对不同浓度ATP(CATP)标准溶液的实时响应光谱曲线，如图5所示。图中曲线a，b，c的CATP分别为100，10，1 nmo1／L，从图中可以看出，在检测开始20 s时将标准ATP与检测试剂混合，反应便迅速发生，其发光量在2～5 s内达到最大值，随后荧光开始呈现不同程度的衰减，CATP为10 nmol／L时对应反应荧光的衰减幅度明显缓于CATP为100 nmol／L时。此外，ATP浓度越高，检测到的光强信号值越高，说明传感器的响应信号与ATP浓度之间存在良好的正向响应关系。本实验中，传感器的响应范围为1～100nmol／L。
5.3 添加剂对传感器信号的影响
为探索传感器灵敏度的改进方法，在检测试剂中加入不同添加剂后，进行传感器对1 nmol／LATP标准品的响应实验，实验结果如图6所示。图中，曲线a为加人0.3 mmol／L CoA；曲线b为不加CoA或KPPi；曲线c为加入0.013 mmol／L KPPi。通过比较光强信号大小可知，加入0.3 mmol／LCoA能将反应产生的荧光光强提高1.5倍，而加入0.013 mmol／L KPPi则将光强信号抑制60％，说明添加剂的加人能显著影响传感器的检测灵敏度，且影响程度因添加剂种类不同而存在显著差异。因此，通过优化检测试剂配方，可以进一步来改进传感器的检测灵敏度，但如何选择确定最佳的添加剂，将在以后进行更深入的研究。
6 结 论
本文主要介绍了一种基于ATP生物发光原理的传感器结构和设计。传感器在结构上采用集成化设计，具有无需微生物培养过程、操作简单及响应快的优点，可适用于对物体表面的微生物总数进行现场快速检测。通过对传感器基本特性的初步研究结果发现，该传感器具有约550 nm的最大光学响应波长，在此检测波长下，检测的荧光强度在1～100 nmol／L ATP浓度范围内与ATP浓度之间呈现出良好的正响应关系。此外，通过如加入一定CoA等方式来优化检测试剂配方，可以进一步来改进传感器的检测灵敏度，但如何选择最佳的添加剂，将在以后进行更深入的研究。
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